分光光度計的結構與使用方法
1. 分光光度法定義與應用
1.1 定義: 分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來(lái)鑒別物質(zhì)或測定其含量的分析檢測技術(shù).
1.2 特點(diǎn): 靈敏,精確,快速和簡(jiǎn)便,在復雜組分系統中,不需要分離,即能檢測出其中所含的極少量物質(zhì). 1.3 應用: 生物<>化學(xué)研究中廣泛使用的方法之一,廣泛用于糖,蛋白質(zhì),核酸,酶等的快速定量檢測. 
2. 分光光度計的基本結構和工作原理
2.1 分光光度計的分類(lèi)
2.2 分光光度計工作原理
2.3 分光光度計的基本結構
2.4 分光光度法的測量誤差
2.5 顯色反應及其影響因素
2.1 分光光度計的分類(lèi)
分光光度計的分類(lèi)
紅外分光光度計: 測定波長(cháng)范圍為大于760 nm的紅外光區
可見(jiàn)光分光光度計: 測定波長(cháng)范圍為400~760 nm的可見(jiàn)光區
紫外分光光度計: 測定波長(cháng)范圍為200～400 nm的紫外光區
2.2 分光光度計工作原理
人眼可見(jiàn)的光只占電磁波譜的很小—部分(400~760nm)
它是一種頻率較大的電磁波.電磁波按頻率大小,從頻率最小的無(wú)線(xiàn)電波到頻率比較大的γ-射線(xiàn)排成一列,即組成電磁波的波譜,
2.2.1 分光光度計的光譜范圍
包括波長(cháng)范圍為400~760 nm的可見(jiàn)光區和波長(cháng)范圍為200～400 nm的紫外光區.不同的光源都有其特有的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源.
鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400～760nm波長(cháng)的光譜,光通過(guò)三棱鏡折射后,可得到由紅,橙,黃,綠,藍,靛,紫組成的連續色譜;該色譜可作為可見(jiàn)光分光光度計的光源.
氫燈的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185～400 nm波長(cháng)的光譜,可作為紫外光光度計的光源.
2.2.2 物質(zhì)的吸收光譜(1) 
如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液,此時(shí)在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜,它出現了幾條暗線(xiàn),即光源發(fā)射光譜中某些波長(cháng)的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱(chēng)為該溶液的吸收光譜.
不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的.因此根據吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質(zhì). 
2.2.2 物質(zhì)的吸收光譜(2)
當光線(xiàn)通過(guò)某種物質(zhì)的溶液時(shí),透過(guò)的光的強度減弱.因為有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被組成此溶液的物質(zhì)所吸收,只有一部分光可透過(guò)溶液.
入射光 = 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透過(guò)光
如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的損失,則:
入射光 = 吸收光 十 透過(guò)光 
2.2.3 物質(zhì)吸光度(A)與透射比(T)的關(guān)系
設 I0 為經(jīng)過(guò)空白校正后入射光的強度;I 為透過(guò)光的強度.
根據實(shí)驗得知 I = I0 ?10-εc l
式中,c 表示吸收物質(zhì)的摩爾濃度;l 表示吸收物質(zhì)的光徑,用cm表示;ε表示吸收物質(zhì)的摩爾消光系數,它表示物質(zhì)對光的吸收特性,不同物質(zhì)的ε數值不同. 所以 I / I0 = 10-εc l 
令 T(透射比) = I / I 0 T = 10-εcl 
若以T對吸收物質(zhì)的濃度作圖,則得圖1-5-2中的曲線(xiàn).
由上式可得 1g(1 / T) = εc l 
lg(l / T)為物質(zhì)的吸光度(A) A = 1g(1 / T) 
2.2.4 Lambert -Beer定律( E = εc l)
上式說(shuō)明了物質(zhì)的吸光度與吸收物質(zhì)的濃度和液層的厚度成正比,這就是光吸收的基本定律--Lambert-Beer(朗伯-比耳)定律.
2.3 分光光度計的基本結構
無(wú)論哪一類(lèi)分光光度計都包括 :光源,單色器,吸收池,檢測器和測量?jì)x表.分光光度計各部件的次序如圖所示: 
5個(gè)基本部件
分光光度計的基本部件(1):
光 源: 分光光度計上常用的光源有兩種:鎢絲燈或氫燈,在可見(jiàn)光區,近紫外光區和近紅外光區常用鎢絲燈作為光源;在紫外光區多使用氫弧燈.
單色器:把混合光波分解為單—波長(cháng)光的裝置.在分光光度計中多用 作為色散元件.
吸收池比色杯,比色皿,比色池)一般由玻璃,石英或熔凝石英制成,用來(lái)盛被測的溶液.在低于350 nm的紫外光區工作時(shí),必須采用石英池或熔凝石英池.  
分光光度計的基本部件(2):
吸收池(比色皿)必須與光束方向垂直.此外,每套比色皿的質(zhì)料,厚度應完全相同,以免產(chǎn)生誤差.比色皿上的指紋,油污或壁上的沉積物都會(huì )顯著(zhù)地影響其透光性,因此在使用前務(wù)必徹底清洗.
常用光電池,光電管和光電倍增管三種. 
測量裝置 —般常用的紫外光和可見(jiàn)光分光光度計有3種測量裝置,即電流表,記錄器和數字示值讀數單元.現代的儀器常附有自動(dòng)記錄器,可自動(dòng)描出吸收曲線(xiàn). 
檢測器
棱鏡與光柵
棱 鏡: 光波通過(guò)棱鏡時(shí),不同波長(cháng)的光折射率不同;因而能將不同波長(cháng)的光分開(kāi).玻璃對紫外線(xiàn)的吸收力強,故玻璃棱鏡多用于可見(jiàn)光分光光度計.石英棱鏡可在整個(gè)紫外光區傳播光,故在紫外光分光光度計中廣為應用.
衍射光柵: 在石英或玻璃表面上刻劃許多平行線(xiàn)(每英寸約刻15 000—30 000條).由于刻線(xiàn)處不透光,通過(guò)光的干涉和衍射使較長(cháng)的光波偏折角度大,較短的光波偏折角度小,因而形成光譜.
棱鏡單色器裝置示意圖
光源照到棱鏡(或光柵)以前,先要經(jīng)過(guò)一個(gè)入射狹縫,再通過(guò)平行光鏡使成為平行光束投到棱鏡上.透過(guò)棱鏡的光再經(jīng)另一聚光鏡,在此聚光鏡的焦面內可得一清 楚的光譜圖.如在焦線(xiàn)處放—出射狹縫,轉動(dòng)棱鏡使光譜移動(dòng),就可以從出射狹縫射出所需要的單色光.整個(gè)裝置稱(chēng)為"單色器"
檢測器---光電池
光電池 裝在一個(gè)特制的匣子里面由3層物質(zhì)組成的圓形或長(cháng)方形薄片.第一層是一種導電性良好的金屬,這是光電池的負極.中間極薄的一層是半導體硒,第3層是鐵,這 是光電池的正極.當光電池受光照射以后,半導體硒的表面逸出電子,這些電子只向負極方向移動(dòng),而不向正極移動(dòng),因此在上下兩金屬片間產(chǎn)生一個(gè)電位差,線(xiàn)路 連通時(shí)即產(chǎn)生電流 
檢測器---光電管
光電管 光電管是由封裝在真空透明封套里的一個(gè)半圓柱型陰極和一個(gè)絲陽(yáng)極組成.陰極的凹畫(huà)上有一層光電發(fā)射材料,此種物質(zhì)經(jīng)光照射可發(fā)射電子.當在兩極間加有電位 時(shí),發(fā)射出來(lái)的電子就流向絲陽(yáng)極而產(chǎn)生光電流.對于相同的輻射強度,它所產(chǎn)生的電流約為光電池所產(chǎn)生電流的1/4.由于光電管具有很高的電阻,所以產(chǎn)生的 電流容易放大 .
檢測器---光電倍增管 
光電倍增管 它比普通的光電管優(yōu)越,它可將第一次發(fā)射出的電子數目放大到數百萬(wàn)倍 .當電子打在兼性陽(yáng)極上時(shí),能引起更多的電子自表面射出.這些射出的電子又被第二個(gè)兼性陽(yáng)極所吸引,同樣再產(chǎn)生更多的電子.
此過(guò)程重復9次后,每個(gè)光子可形成106~107個(gè)電子.這些電子最后被收集在陽(yáng)極上.所得到的倍增電流可進(jìn)一步加以放大和測量.